dpph清除率大于100%是什么意思 dpph清除率正常范围

2023-08-21 18:00:02科技漂亮的斑马

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一、dpph清除率大于100%是什么意思

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，别名1,1-二苯基-2-三硝基肼（自由基）； 1,2-二苦基-2-三硝基苯肼肼； 1,2-二苯基-2-哌肼。它是一种自由基，性质稳定，性质稳定，为深紫色棱柱状晶体，熔点127-129（分解）。最大吸收波长为528nm。可用作光度测定生育酚、脂肪族硫醇、还原性物质的分析试剂，也是常用的阻聚剂。

明确测试

原则

DPPH法于1958年提出[2]，广泛用于定量测定生物样品和食品样品的抗氧化能力。该方法是基于DPPH自由基具有单电子，在517nm处有强吸收，其醇溶液呈紫色。当存在自由基清除剂时，其吸收因与其单个电子配对而逐渐消失，其消退程度与其接受的电子数有定量关系，因此可用分光光度计进行快速定量分析。实验流程

1、用无水乙醇配制0.1mmol/L DPPH溶液，避光保存。配制0.5mg/mL Vc 溶液（作为对照）。测试样品被稀释成不同的浓度。 2. 将2mL测试样品溶液和2mL DPPH溶液加入同一试管中，摇匀，室温避光放置30min后测定A样品的吸光度，并量取2mL DPPH溶液和2mL溶剂（蒸馏水或过敏缓冲液）为混合后的吸光度A对照，以及2mL测试样品溶液与2mL无水乙醇混合后的吸光度A空白。

3、自由基清除能力的表现：

清除率越大，抗氧化能力越强。为了更直观地展示样品的抗氧化能力，一般会使用其他常见的抗氧化剂作为对照，例如Vc。通过绘制Vc浓度与清除率之间的工作曲线，可以用Vc当量浓度来表示样品清除自由基的能力。

最大通关率只能是100%，不可能超过100%！

二、乙酰化离心没有上清液

无上清乙酰化离心：乙酰化获得的新型抗肿瘤化合物。制备方法如下：（1）取干黑灵芝100g，加入95%乙醇室温浸泡48h，过滤，重复一次，将药渣置于室温通风处干燥，然后将药渣与蒸馏水按质量体积（kg/L）1:20的比例混合，回流提取两次，每次提取时间为2h、1h，合并提取液，离心，减压浓缩；将得到的样品加入适量的95%乙醇，使溶液中乙醇的体积分数为80%，然后沉淀，4静置24h，离心过滤。合并沉淀，依次用无水乙醇、无水乙醚、丙酮洗涤沉淀，冻干得样品；获得干燥样品，用Sevag法去除蛋白质，即Sevag试剂（体积比氯仿：正丁醇=5:1）与干燥样品按质量比1:1混合，静置，除去下部蛋白质变性层；浓缩样品，重复脱蛋白操作10次；将脱蛋白后的样品浓缩，用95%乙醇洗涤，再次浓缩，冻干，得到粗提物样品；将提取物样品用透析袋透析3天，将袋内样品浓缩至小体积，冷冻干燥，得到黑灵芝提取物； (2)取上述得到的黑灵芝提取物500mg，加蒸馏水制成浓度为35mg/mL的溶液，离心，取上清液进行凝胶柱层析。所用层析系统为Purifier 100生物大分子纯化系统，凝胶柱Hiload 26/60 Superdex-200制备级。样品和洗脱液通过0.22m微孔滤膜保护分离柱，洗脱液为蒸馏水，流速2mL/min，样品体积5mL，分数收集体积8mL/管，UV检测器和差示折光检测器检测（RID-10A差示检测器）在线监测洗脱情况；取6-14管合并，浓缩，冷冻干燥，得黑灵芝提取物PSG，为黄色或棕色絮状固体。 (3)Ac-PSG的制备：称取0.3g冻干PSG放入反应试管中，加入10mL蒸馏水，混匀，加入0.5mol/L NaOH调节pH值至9.0，在40下孵育。 30C 4 小时。在此期间，边搅拌边分6次向溶液中加入一定量的乙酸酐，同时不断滴加0.5mol/L NaOH，使pH值保持在8.0。反应结束后，用5 mol/L HCl调节溶液pH值为7.0时，将混合液放入透析袋中，用蒸馏水透析3天（透析袋的相对分子质量截止值）为8 000-12 000)，向透析袋内液中加入4倍体积的无水乙醇，研磨，过筛，得到白色粉末状产品，记为Ac-PSG。本发明的乙酰化产物Ac-PSG能够刺激巨噬细胞，显着增强巨噬细胞的吞噬能力和细胞上清液中TNF-的蛋白表达，增强机体的免疫功能，进而增强抵抗疾病的能力。还原力强，能中和较多的亚油酸自由基及体系中形成的其他自由基，减缓-胡萝卜素的褪色，可用于抗肿瘤。附图说明图1图1是Ac-PSG1的高效凝胶渗透色谱图。图2是PSG和Ac-PSG3的红外光谱。图3为PSG、Ac-PSG1和Ac-PSG 2 清除DPPH自由基能力的示意图。图4为PSG、Ac-PSG1和Ac-PSG 2抑制-胡萝卜素-亚油酸体系氧化能力示意图。

实施例1：乙酰化得到的新型抗肿瘤化合物。制备方法如下：(1)取干燥黑灵芝药材100g，加95乙醇室温浸泡48小时提取，过滤，重复1次。室温通风处干燥，然后将药渣与蒸馏水按质量体积（kg/L）1：20的比例混合，回流提取两次，每次提取时间为2h、1h，合并提取物，离心，减压浓缩；向所得样品中加入适量95%乙醇，使溶液中乙醇的体积分数为80%，沉淀，4静置24h，离心过滤；无水乙醚、丙酮洗涤沉淀，冻干得样品；将得到的干样采用Sevag法脱蛋白，即将Sevag试剂（体积比氯仿：正丁醇=5：1）与干样按质量比1：1混合，静置，除去下层蛋白变性层；浓缩样品，重复脱蛋白操作10次；脱蛋白样品浓缩后，用95%乙醇洗涤，再次浓缩，冻干，得粗提物样品；将样品用透析袋透析3天，将袋内样品浓缩至小体积，冷冻干燥，得到黑灵芝提取物； (2)取上述黑灵芝提取物500mg，加蒸馏水制成浓度为35mg/mL的溶液，离心，取上清液进行凝胶柱层析。所用层析系统为Purifier 100生物大分子纯化系统，凝胶柱Hiload 26/60 Superdex-200制备级。洗脱液过0.22 m微孔滤膜，保护分离柱，洗脱液为蒸馏水，流速2mL/min，样品体积5mL，分数收集体积8mL/管，紫外检测器和差折光检测器指标检测通过检测器检测（RID-10A差示检测器）在线监测洗脱情况；取第6至第14管合并，浓缩，冷冻干燥，得黑灵芝提取物PSG，为黄色或棕色絮状固体。 (3) Ac-PSG 制备：称取0.3 g 冻干PSG 放入反应试管中，加入10 mL 蒸馏水，混匀，加入0.5 mol/L NaOH 调节pH 值至9.0，30 孵育C 4 小时。在此期间，在搅拌下分6次向溶液中加入1mL乙酸酐，并连续滴加0.5mol/L NaOH，使pH值保持在8.0。反应结束后，用5 mol/L HCl调节溶液pH值7.0，将混合物置于透析袋中，蒸馏水透析3 d（透析袋相对分子质量截留为8 000） -12 000)，向透析袋内液体中加入4倍体积的无水乙醇反复沉淀，待乙醇蒸发后，研磨过筛，得到白色粉末状产品，分别记为Ac-PSG1 。

实施例2：通过乙酰化获得的新型抗肿瘤化合物。制备方法如下：（1）取干燥黑灵芝药材100克，加95%乙醇室温浸泡提取48小时，过滤，重复一次，药渣置于室温干燥。置于通风处，然后将药渣与蒸馏水按质量体积（kg/L）1：20的比例混合，回流提取两次，每次提取时间2h，依次1h，合并提取液，离心，浓缩减压；向所得样品中加入适量95%乙醇，使溶液中乙醇体积分数为80%，沉淀，4放置24小时，离心过滤；将沉淀用乙醚、丙酮洗涤，冷冻干燥，得到样品；将得到的干样用Sevag法去除蛋白，即Sevag试剂(体积比氯仿：正丁醇=5:1)与干样按质量比1:1混合。均匀后，静置，除去下层蛋白变性层；浓缩样品，重复去蛋白操作10次；去蛋白样品浓缩后，用95%乙醇洗涤样品，再次浓缩，冻干，得到粗提物样品；将粗提物样品用透析袋透析3天，将袋内样品浓缩至小体积，冷冻干燥，得到黑灵芝提取物； (2)取上述得到的黑灵芝提取物500mg，加蒸馏水制成浓度为3-5mg/mL的溶液，离心，取上清液进行凝胶柱层析。所用色谱系统为Purifier 100生物大分子纯化系统，凝胶柱为Hiload 26/60 Superdex-200制备级。上样和洗脱前液体通过0.22m微孔膜保护分离柱，洗脱液为蒸馏水，流速2mL/min，样品体积5mL，分数收集体积8mL/管，并由紫外检测器和差示折光检测器检测（RID-10A差示检测器）在线监测洗脱情况；取6-14管合并，浓缩，冷冻干燥，得黑灵芝提取物PSG，为黄色或棕色絮状固体。 (3) Ac-PSG 的制备：称取0.3 g 冻干PSG 置于反应试管中，加入10 mL 蒸馏水，混匀，加入0.5 mol/L NaOH 调节pH 值至9.0，孵育30C 4 小时。在此期间，在搅拌下分6次向溶液中加入3 mL乙酸酐，并连续滴加0.5 mol/L NaOH，使pH值保持在8.0。反应结束后，用5 mol/L HCl调节溶液pH值7.0，将混合物置于透析袋中，蒸馏水透析3 d（透析袋相对分子质量截留为8 000） -12 000)，向透析袋内液体中加入4倍体积的无水乙醇反复沉淀，待乙醇蒸发后，研磨过筛，得到白色粉末状产品，分别记为Ac-PSG2 。

实施例3：通过乙酰化获得的新型抗肿瘤化合物。制备方法如下：（1）取干燥黑灵芝药材100克，加95%乙醇室温浸泡提取48小时，过滤，重复一次，药渣置于室温干燥。置于通风处，然后将药渣与蒸馏水按质量体积（kg/L）1：20的比例混合，回流提取两次，每次提取时间2h，依次1h，合并提取液，离心，浓缩减压；向所得样品中加入适量95%乙醇，使溶液中乙醇体积分数为80%，沉淀，4放置24小时，离心过滤；将沉淀用乙醚、丙酮洗涤，冷冻干燥，得到样品；将得到的干样用Sevag法去除蛋白，即Sevag试剂(体积比氯仿：正丁醇=5:1)与干样按质量比1:1混合。均匀后，静置，除去下层蛋白变性层；浓缩样品，重复去蛋白操作10次；去蛋白样品浓缩后，用95%乙醇洗涤样品，再次浓缩，冻干，得到粗提物样品；将粗提物样品用透析袋透析3天，将袋内样品浓缩至小体积，冷冻干燥，得到黑灵芝提取物； (2)取上述得到的黑灵芝提取物500mg，加蒸馏水制成浓度为3-5mg/mL的溶液，离心，取上清液进行凝胶柱层析。所用色谱系统为Purifier 100生物大分子纯化系统，凝胶柱为Hiload 26/60 Superdex-200制备级。上样和洗脱前液体通过0.22m微孔膜保护分离柱，洗脱液为蒸馏水，流速2mL/min，样品体积5mL，分数收集体积8mL/管，并由紫外检测器和差示折光检测器检测（RID-10A差示检测器）在线监测洗脱情况；取6-14管合并，浓缩，冷冻干燥，得黑灵芝提取物PSG，为黄色或棕色絮状固体。 (3) Ac-PSG 的制备：称取0.3 g 冻干PSG 置于反应试管中，加入10 mL 蒸馏水，混匀，加入0.5 mol/L NaOH 调节pH 值至9.0，孵育30C 4 小时。在此期间，边搅拌边分6次向溶液中加入5mL乙酸酐，并连续滴加0.5mol/L NaOH，使pH值保持在8.0。反应结束后，用5 mol/L HCl调节溶液pH值7.0，将混合物置于透析袋中，蒸馏水透析3 d（透析袋相对分子质量截留为8 000） -12 000)，向透析袋内液体中加入4倍体积的无水乙醇反复沉淀，待乙醇蒸发后，研磨过筛，得到白色粉末状产品，分别记为Ac-PSG3 。一、产品的理化性质对实施例1-3制得的Ac-PSG进行红外光谱分析和乙酰化度的测定，同时测定纯度、平均分子量、糖醛酸含量。 (1) 纯度鉴定采用高效渗透凝胶色谱检测纯度，取供试品3 mg，溶于1 mL 蒸馏水中，1000 rpm 离心10 min，过滤后自动上样20 L 样品用微孔滤膜过滤，并记录洗脱曲线，以确定纯度组分的纯度。实验所用HPLC具体测试条件如下：色谱柱为UltraHydrogelTM500 300mm7.8mmid；流动相为0.1M NaCl；流速为0.6mL/min；柱温为35C。 (2)分子量测定的液相色谱柱为UltraHydrogelTM500 300mm7.8mmid，流动相为0.1M NaCl，流速0.6mL/min，柱温35。配制各标准Glc、T10、T40、T70、T500、T2000的2%溶液，将各溶液进样后HPLC得到相应的液相图谱。设T2000的洗脱体积为柱的死体积V0，Glc的洗脱体积为柱的总体积Vt，按公式Kav=(Ve-V0)/(Vt-V0)计算，并使用LogMw-Kav 绘图以获得标准曲线。根据样品的Ve，从标准曲线上即可得出样品的分子量。

由于洗脱液流量恒定，可以绘制保留时间与分子量关系的标准曲线，根据其回归方程即可得到各产物的分子量。 (3)糖醛酸含量的测定以半乳糖醛酸为标准品，采用改良硫酸咔唑法测定糖醛酸含量。 b. HPLC色谱条件色谱柱：Sugar-Pak(300mm6.5mm)，流动相：0.0001mol/L EDTA水溶液，流速：0.6mL/min，差示检测器，柱温：90，差示检测池温度： 40，进样量：20L。标准曲线的绘制精密称取半乳糖醛酸对照品适量，加超纯水溶解，摇匀，制成0.16432、0.32864、0.49296、0.65728、0.8216、0.98592、1.15024、1.31456、1.47888mg系列标准溶液/毫升。按上述色谱条件，分别进样20 L，测定半乳糖醛酸的峰面积。以半乳糖醛酸的峰面积为横坐标，对照品浓度（mg/mL）为纵坐标，绘制标准曲线。求回归方程。样品糖醛酸含量的测定称取一定量样品，加超纯水溶解并定容至10mL，制备样品溶液。根据制作标准曲线时的色谱条件，通过回归方程计算出样品中糖醛酸的含量。 (4) 红外光谱(IR) 分析取1-2mg 样品，使用KBr 颗粒进行常规红外分析。红外光谱仪参数如下：背景扫描次数：128次；分辨率：4.0cm-1；探测器：DTGS。 (5)乙酰化度的测定取乙酰化Ac-PSG样品10mg置于指形试管中，将试管和样品放入五氧化二磷干燥器中，80干燥8小时。向试管中加入0.5mL 2.0mol/L HCl-无水甲醇溶液，将试管在乙醇-干冰浴中冷却，用氧气炬密封，在100下保持4小时进行甲醇解。冷却后，打开试管，将试管连同内容物小心放入蒸馏室，在4000Pa-5330Pa的真空度下进行蒸馏。蒸馏室温度保持在35-45。当酸性甲醇全部蒸发后，再向试管中加入无水甲醇，然后进行蒸馏，将两次馏出液收集合并于试管中，进行比色测定。将装有馏出液的试管置于20--25水浴中1-2min，加入1mL水，再加入2mL 0.75mol/L高氯酸溶液，再加入1mL高氯酸铁溶液。 5分钟后，在520nm波长下测定吸光度值。标准溶液为1-10 mol 乙酸甲酯溶于2 mL 甲醇-水（1: l，v/v），空白溶液为所用的HCl-甲醇溶液。 Ac-PSG的修饰程度以Ac-PSG中乙酰基的含量(AC%)表示，或以取代度(DS)表示：取代度DS=1.62Ac%/(43-0.42 Ac%)表1 各产物的平均分子量和基团取代度由表1可见，随着乙酰化试剂用量的增加，乙酰基取代度也逐渐从0.71增加到1.04，且乙酰化试剂的用量对Ac-PSG的影响较大，对Ac-PSG的分子量影响很大。随着乙酰化程度的加深，Ac-PSG的分子量逐渐减小。可能是在乙酰化过程中一些糖苷键被破坏。在红外光谱图2中，可以清楚地看出乙酰化PSG在1735cm-1-1750cm-1(c=o)和1200cm-1-1230cm-1(c-o)处比PSG有更强的吸收峰，这是乙酸酐与PSG中的羟基反应形成的羧酸盐的吸收峰，证明了乙酰基的存在。最明显的是乙酰化的PSG在1365cm-1-1380cm-1（SCH3）处有一个吸收峰，而由于PSG不含甲基，所以没有这个峰。修饰程度越高，这个峰的面积就越大。大的。上述谱图中出现了3600-3100cm-1处的-O-H伸缩振动吸收峰，表明乙酰基尚未取代全部羟基。

二、功能活性研究1.体外免疫活性实验（一）巨噬细胞的分离纯化颈椎脱位处死小鼠2只，先放入聚维酮碘3-5分钟，然后放入体积比75%乙醇中馏分在培养基中浸泡5分钟脱色，腹腔内注入10mL PBS缓冲液，用棉球轻轻揉搓腹部1-2分钟，然后吸取腹腔液至离心管中，1000r/min离心5分钟，弃上清，收集巨噬细胞，胎儿泛蓝染色，确认细胞存活率在95%以上，用RPMI-1640培养基将细胞密度调整至1.5105个细胞/mL。将巨噬细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，二氧化碳培养箱(5%CO2、37)培养3小时，然后轻轻吸弃培养液，洗去未附着的细胞。细胞经PBS缓冲，即获得纯化的腹腔巨噬细胞。 (2)实验分组及处理纯化后的巨噬细胞用RPMI-1640培养基调整至细胞密度为5105/mL，分为空白对照组(PBS)、阳性对照组(LPS)和不同剂量的给予巨噬细胞。药物组接种于96孔培养板中，每组3个重复孔。每孔培养液总体积为100 L，给药组添加的GP终浓度分别为0、10、100、200、400 g/mL，阳性对照组RPMI-1640培养含有LPS的溶液最终浓度为2g/mL。将各试验组置于二氧化碳培养箱（5%CO2、37）中培养所需时间，根据不同的测量方法进行不同的处理，测量各指标。 (3)巨噬细胞吞噬功能的检测参照王晓静的方法进行。调节巨噬细胞浓度至5105/mL，每孔接种100 l于96孔板，置于5% CO2中，37孵育3小时，洗去未贴壁细胞。每孔加入100 L含10%小牛血清的RPMI-1640，按所需剂量加入药物孵育。培养48 h后，每孔加入100 l 0.1%中性红盐水溶液，继续培养4 h，倒掉上清，PBS洗3次，加入100 L细胞裂解液（冰醋酸：乙醇）=1:1）每孔，4放置2-3h，细胞裂解后在酶标仪上测定540nm吸光度。 (4)检测TNF-蛋白表达TNF-诱导：将100g/mL样品加入制备好的巨噬细胞中，5%CO2、37孵育48小时，收集巨噬细胞上清，-70保存用于测定TNF- 活性。细胞上清TNF-的Western blot方法：以牛血清白蛋白为标准蛋白，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，分装样品，-70保存。根据各样品的蛋白浓度计算上样量，将细胞上清液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。通过电泳将凝胶上的样品转移到PDVF膜上。加入一抗山羊抗TNF-，4孵育10-14h，然后加入HRP标记二抗兔抗山羊IgG-G孵育，最后用ECL法显色固定，用 -肌动蛋白作为内参。 (5)统计处理所有数据均以平均值标准差(xs)表示，数据采用SPSS11.0统计软件进行处理，检验水准为=0.05。 2.对DPPH的体外抗氧化活性实验(1)自由基的清除作用，因为本发明的产品不溶于高浓度的乙醇溶液，所以要测定本发明的产品对DPPH的清除作用自由基，还需要对其方法进行一定的改进，改进的方法如下：DPPH为95%乙醇配成0.2mmol/L溶液。取不同浓度的样品溶液1mL、新配制的DPPH乙醇溶液2mL和95%乙醇2mL于同一具塞试管中，混匀，避光反应30min，取出，测定525nm处的吸光度。空白组用2 mL 95%乙醇代替DPPH溶液，对照组用2 mL DPPH溶液与3 mL 95%乙醇混合。每组样品重复三次，取平均值。

反应体系的吸光度越低，清除DPPH自由基的能力越强。 DPPH自由基清除率计算公式为：清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac]100% 其中，Ai为样品组吸光度值，Aj为空白组吸光度值，Ac为对照组的吸光度值。 (2)对-胡萝卜素-亚油酸体系氧化的抑制采用胡萝卜素漂白法考察样品对-胡萝卜素-亚油酸氧化体系的抑制效果。将5mg -胡萝卜素溶于50mL氯仿中，加入40mg亚油酸和400mg去尔通X-100，40旋转蒸发浓缩5分钟除去氯仿，加入100mL氧饱和蒸馏水，充分混合制成乳液体系。取上述制备的乳液4.5mL，加入不同浓度的样品溶液或0.5mL超纯水，混匀，测定470nm处的吸光度值作为零时吸光度。将反应液置于50水浴中2小时后，再次测定470nm处的吸光度。以不含-胡萝卜素的反应液作为空白试剂，BHT作为阳性对照。根据-胡萝卜素的褪色情况，按下式计算样品的抗氧化率（%）：其中，A0、A0'分别为样品和空白组在零时的吸光度； At、At'分别为反应2小时后的吸光度。 3.结果与讨论(1)各受试物对巨噬细胞吞噬作用的影响。非特异性免疫反应是机体固有的免疫特性，如机体皮肤表面的天然屏障、干扰病毒复制、吞噬细胞对异物的吞噬等生理、化学和细胞防御作用。巨噬细胞参与非特异性免疫，其吞噬功能是免疫系统维持自身内环境稳定的重要手段，也是机体产生免疫反应的基础。大多数抗原经过巨噬细胞加工，其免疫原性大大增加。因此，吞噬作用是非特异性免疫的关键环节。测定小鼠巨噬细胞的吞噬能力，一般是观察巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬情况，通过计数计算吞噬百分比。本发明通过在细胞培养液中加入不同终浓度的测试物质来测定巨噬细胞吞噬中性红的能力，根据测得的OD值确定各样品对巨噬细胞吞噬能力的影响。

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