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一、三氨基甲烷是危化品吗?

二、DG55155Tl设置方法?

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一、三氨基甲烷是危化品吗?

三氨基甲烷不是危险化学品

Tris中文名三(羟甲基)氨基甲烷,又称氨丁三醇、氨丁三醇等,为白色晶体颗粒,化学式为C4H11NO3。作为生物缓冲液家族的中流砥柱,它也被广泛用作核酸和蛋白质溶剂。

Tris 用途广泛,在化妆品中充当缓冲剂。常见于一些高档化妆品中,涵盖日系、韩系、欧美系列。

TRIS也被添加到许多涂料中,主要作为pH调节剂、交联促进剂、聚酯涂料原料和相变芯材。

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二、DG55155Tl设置方法?

团体标准T/CVMA 5—2018 非洲猪瘟病毒实时PCR检测方法中国兽医协会发布前言本标准根据GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由中国兽医协会提出并归口。本标准起草单位:中国动物疫病预防控制中心、中国兽药检验所、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国农业科学院兰州兽医研究所、北京海关。本标彩霞、夏英菊、杨继飞、徐璐、顾晓雪、康文华、李硕、毕一鸣。1、范围本标准规定了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法的试剂、仪器及耗材、操作步骤、结果判断、实验室生物安全等技术要求。本标准适用于猪脾脏、淋巴结、血液等组织和血粉中非洲猪瘟病毒核酸的检测。2、规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存和运输技术规范:3、试剂3.1 DNA 提取试剂DNA 提取试剂的制备参见附录A,或选择市售的病毒DNA 提取试剂试剂盒并参照说明书进行DNA提取。 3.2 2PCR缓冲液2PCR缓冲液的制备参见附录A。 3.3 引物和探针3.3.1 使用针对非洲猪瘟病毒VP72 基因的引物和探针(核苷酸序列见附录B):上游引物ASF-CADC-rPCRF:5'-1528-ATAGAGATACAGCCTCTTCCAG-1548-3'下游引物ASF-CADC-rPCRR: 5'-1660-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3' 荧光探针ASF-CADC-Probe: 5'-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-1653-3' 3.3.2 世界动物卫生可使用引物以及世界动物卫生组织(OIE)《陆生动物诊断试验和疫苗手册》(Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals)第2.8.1章非洲猪瘟中规定的检测程序和标准。手动操作: 上游引物ASF-OIE-rPCRF:5'-1627-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-1651-3' 下游引物ASF-OIE-rPCRR:5'-1857-GATACCACAAGATCRGCCGT-1876-3' 荧光探针ASF-OIE-Probe:5 '-1761-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-1785-3'3.3.3 使用国家农业行政主管部门认可的其他引物和探针,并相应调整检测程序和判断标准。 3.4 阴性对照和阳性对照阴性对照和阳性对照的制备方法见附录C。 3.5 其他试剂消毒剂、5U/L Taq DNA 聚合酶、无菌无核酸酶水、0.01mol/L PBS(pH7.2)。消毒剂配制见附录A,0.01mol/L PBS配制见附录A。4、仪器及耗材分析天平(灵敏度0.1mg)、高速台式冷冻离心机(最高离心转速不低于12 000r/min)、冰盒、实时荧光PCR仪及配套反应管(板) 、组织研磨机、-20冰箱、可调移液器(2 L、20 L、200 L、1 000 L)、1.5 mL 离心管(无核酸酶)。5、操作步骤5.1 样品采集和运输样品采集和运输按照NY/T541的规定进行。采集猪的脾脏、淋巴结、血液等组织材料或血粉进行检测,样品应在冷藏条件下尽快运至实验室。室内,避免反复冻融。采样时应穿戴个人生物安全防护用品,并进行现场消毒和废物处理。 5.2 样品处理检测前样品应在二级生物安全柜中进行处理。取组织或血粉0.1g0.2g,研磨粉碎,加入1mL 0.01mol/L PBS(pH7.2)制成匀浆,12 000 r/min离心2min,取上清;直接取全血和血清样品1 mL,置于1.5 mL离心管中,并盖紧管盖。将上述处理过的样品在60下灭活30分钟。 5.3 样品保存采集或处理后的样品在28保存不应超过24小时;如需长期保存,应置于-70冰箱内,但应避免反复冻融(冻融次数不超过3次)。

5.4 病毒DNA提取5.4.1 DNA提取应在制样区按下列方法进行。如果使用其他等效的病毒DNA提取试剂,请按照试剂说明进行操作。 5.4.2 待测样品、阳性对照和阴性对照之和用n表示。取n个已灭菌的1.5mL离心管,并一一编号。 5.4.3 每管加入200 L DNA 提取液1,然后分别加入待测样品、阴性对照和阳性对照各200 L,每个样品更换1 个吸头,在混合器上振荡5 秒。在4C 至25C 下以13 000 r/min 离心10 分钟。 DNA 提取液1 见附录A。 5.4.4 尽可能吸弃上清液,吸头不得接触沉淀,然后加入10 L DNA 提取液2,在混合器上摇匀5 s 。在4C 至25C 下以2 000 r/min 离心10 s。 DNA提取液见附录A 2。 5.4.5 100干浴或沸水浴10分钟。 5.4.6 加入90 L无DNase的灭菌去离子水,13 000 r/min离心10 min,上清液为提取的DNA,-20保存备用。不含DNase 的无菌去离子水参见附录A。 5.5 实时荧光PCR操作5.5.1 在反应混合物制备区、样品制备区和检测区分别进行5.5.2至5.5.4。 5.5.2 每个检测反应系统需使用20L实时荧光PCR反应液。按5.4.2设定的n值,按附录D配制反应液,混匀后分装,每个PCR反应管20L。将PCR 反应管转移至样品制备区。 5.5.3 将5.4提取的DNA溶液5L加入上述5.5.2反应管中,使每管总体积达到25L,记录该反应管对应的样品编号。盖紧管子后,短暂离心。 5.5.4 将5.5.3添加的反应管放入实时荧光PCR检测仪中,记录反应管的顺序。选择5-羧基荧光素(FAM)作为报告基团,选择小沟结合剂(MGB)作为猝灭剂基团。反应参数设置如下:预变性95/3 min; 95/15秒、52/10秒、60/35秒,45个循环;在每个循环的60C 退火延伸时收集荧光。测试结束后,根据采集的Ct值和荧光曲线判断结果。6、结果判断6.1 结果分析条件设置实时荧光PCR检测阈值设置原则:阈值线超过阴性对照扩增曲线的最高点,并与阳性对照扩增曲线进入指数的拐点相交生长期,或根据仪器噪声进行调整。每个样品反应管中的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环次数即为Ct值。 6.2 结果描述与判断当阳性对照Ct值28.0且出现典型扩增曲线,阴性对照无Ct值且无扩增曲线时,实验成立。举例参见附录E。当检测样品具有典型扩增曲线且Ct值38.0时,判定为非洲猪瘟病毒核酸阳性;检测样本无Ct值,判定非洲猪瘟病毒核酸阴性;对于Ct值>38.0且出现典型扩增曲线的样品,应重新检查。复检时若仍出现上述结果,则判定为阳性,否则判定为阴性。7、实验室生物安全要求7.1 本方法涉及非洲猪瘟感染性样品的实验操作应在(动物)生物安全三级实验室进行。实验室生物安全管理要求见GB 19489。国家农业行政主管部门另有规定的,按照其规定。 7.2 用过的实验器材和废液应先用消毒液浸泡,经高温高压处理后废弃。剩余样品等固体废物应密封包装于生物安全柜中,表面消毒后取出,经高温高压处理后废弃。一附录A(规范性附录)试剂的制备A.1 DNA提取液1PEG8000晶体20.74g,NaCL 17.53g,加去离子水定容至100mL。 A.2 DNA 提取液21mol/L Tris.Hcl 2 mL、2 mol/L KCL 5 mL、0.5 mol/L EDTA 0.5 mL、NP-40 1 mL,加去离子水定容至100 mL。即KCL14.912g、Tris碱12.114g、浓HCl 1.2068mL、EDTA14.612g、NaOH 6g,加去离子水至100mL。 A.3 2PCR 缓冲液灭菌去离子水70 mL Tris (Tris) 0.79 g 氯化钾1.865 g Triton X-100 0.5 mLdATP (100mmol/L) 2.5 mLdTTP (100mmol/LL) 2.5 mLdGTP (100mmol/L) 2.5 mLdCTP ( 100mmol/L) 2.5 mL 六水氯化镁0.61 g 盐酸调节pH 至9.0 灭菌去离子水加入到100 mLA 中。 4 消毒剂8% 氢氧化钠或3% 福尔马林或3% 邻苯基苯酚或碘化合物等其他消毒剂是可以接受的。

A.5 磷酸盐缓冲盐水(PBS)配方A.5.1 溶液A 0.2mol/L 磷酸二氢钠水溶液:NaH2PO4H2O 27.6 g,加蒸馏水溶解,最后定容至1000 mL。 A.5.2 溶液B 0.2mol/L 磷酸氢二钠水溶液:Na2HPO47H2O 53.6 g(或Na2HPO412H2O 71.6 g 或Na2HPO42H2O 35.6 g),加蒸馏水溶解,定容至1000 mL。 A.5.3 0.01 mol/L、pH 7.2 磷酸盐缓冲盐水(PBS)的制备取A 液14 mL,B 液36 mL,加8.5 g NaCl,用蒸馏水稀释至1 000 mL。过滤灭菌后,在无菌条件下分装。 A.6 无DNase 灭菌去离子水无DNase 灭菌去离子水为经1PC 处理的去离子水,电阻应大于18.2m。附录B(资料性附录) 非洲猪瘟病毒VP72基因参考序列1ATGGCATCAG GAGGAGCTTT TTGTCTTATT GCTAACGATG GGAAGGCCGA CAAGATTATA61TTGGCCCAAG ACTTGCTGAA TAGCAGGATC TCTAACATTA AAAATGTGAA CAAAAGTTAT121GGGAAACCCG ATCCCGAACC CACTTTGAGT CAAA TCGAAG AAACACATTT GGTGC ATTTT181AATGCGCATT TTAAGCCTTA TGTTCCAGTA GGGTTTGAAT ACAATAAAGT ACGCCCGCAT241ACGGGTACCC CCACCTTGGG AAACAAGCTTT ACCTTTGGTA TTCCCCAGTA CGGAGACTTT301TTCCATGATA TGGTGGGCCA TCATATATTG GGTGCATGTC A TTCATCCTG GCAGGATGCT361CCGATTCAGG GCACGTCC CA GATGGGGGCC CATGGGCAGC TTCAAACGTT TCCTCGCAAC421GGATATGACT GGGACAACCA AACACCCTTA GAGGGCGCCG TTTACACGCT TGTAGATCCT481TTTGGAAGAC CCATTGTACC CGGCACAAAG AATGCGTACC GAAACTTGGT TTACTACTGC541GAATACCCCG GAGAACGACT TTATGAAAAC GTAAGATTCG ATGTAA ATGG AAATTCCCCTA601GACGAATATA GTTCGGATGT CACAACGCTT GTGCGCAAAT TTTGCATCCC AGGGGATAAA661ATGACTGGAT ATAAGCACTT GGTTGGCCAG GAGGTATCGG TGGAGGGAAC CAGTGGCCCT721CTCCTATGCA ACATTCATGA TTTGCACAAG CCGCACCAAA GCAA ACCTAT TCTTACCGAT781GAAAATGATA CGCAGCGAAC GTGTAGCCAT ACCAACCCGA AATTTCTT TC ACAGCATTTT841CCCGAGAACT CTCACAATAT CCAAACAGCA GGTAAACAAG ATATTACTCC TATCACGGAC901GCAACGTATC TGGACATAAG ACGTAATGTT CATTACAGCT GTAATGGACC TC AAACCCCT961AAATACTATC AGCCCCCTCT TGCGCTCTGG ATTAAGTTGC GCTTTTGGTT TAATGAGAAC1021GTGAACCTTG CTATTCCCTC AGTATCCATT CCCTTCGGCG AGCGCTTTAT CACCATAAAG1081CTTGCATCGC AAAAGGATTT GGTGAATGAA TTTCCTGGAC TTTTTGTACG CCAGTCACGT1141TTTATAGCTG GACGCCCCAG TAGACGCAAT ATAC GCTT TA AACCATGGTT TATCCCAGGA1201GTCATTAATG AAATCTCGCT CACGAATAAT GAACTTTACA TCAATAACCT GTTTGTAACC1261CCTGAAATAC ACAACCTTTT TGTAAAACGC GTTCGCTTTT CGCTGATACG TGTCCATAAA1321ACGCAGGTGA CCCACACCAA CAATAACCAC CACGATGAAA A ACTAATGTC TGCTCTTAAA1381 TGGCCCATTG AATATATGTT 塔塔加塔AAAACCTACCT GGAACTACCTC CGATCAAAAT1441CCTCATCAAC ACCGAGATTG GCACAAGTTC GGACATGTTG TTAACGCCAT TATGCAGCCC1501ACTCACCACG CAGAGATAAG CTTTCAGGAT AGAGATACAG CTCT TCCAGA CGCATGTTCA1561TCTATATCTG ATATTAGCCC CGTTACGTAT CCGATCACAT TACCTATTAT TAAAACATT1621TCCGTAACTG CTCATGGTAT CAATCTTATC GATAAATTTC CATCAAAGTCTGCAGCTCT1681TACATACCCT TCCACTACGG AGGCAATGCG ATTAAAACCC CCGATGATCC GGGTGCGATG1741ATGATTACC T TTGCTTTGAA GCCACGGGAG GAATAC CAAC CCAGTGGTCA TATTAACGTA1801TCCAGAGCAA GAGAATTTTA TATTAGTTGG GACACGGATT ACGTGGGGTC TATCACTACG1861GCTGATCTTG TGGTATCGGC ATCTGCT 附录C(规范性附录) 非洲猪瘟病毒核酸阳性对照和阴性对照C.1阳性对照阳性对照制备方法:人工合成非洲猪瘟病毒VP72基因片段,序列见附录B,将VP72基因与pMD20-T载体连接,制作阳性质粒pMD20-T-VP72,将质粒稀释至浓度10 000拷贝/L,-20保存备用。 C.2 阴性对照阴性对照为非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液。 4 附录D(规范性附录) 实时荧光PCR 反应液配方实时荧光PCR 反应液配方见表D.1。表D.1 实时荧光PCR 反应液成分1 个检测系统添加量2PCR Buffer a12.5 L dNTP (2.5 mmol/L) 1.0 L 上游引物(10 mol/L) 1.0 L 下游引物(10 mol/L) 1.0 L 探针(10 mol/L) 1.0 L Taq 酶b (5U/L) 0.5 L 去离子水3 L 总体积20 L 2PCR buffer a: 配方参见附录A.1。 Taq酶b:具有5'3'外切活性。五、附录E(资料性附录) 非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例参考图D.1为非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例。

图E.1 非洲猪瘟病毒核酸实时荧光PCR典型扩增曲线示意图(来源:中国兽医协会)

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