小鼠胚胎成纤维细胞的培养 丝裂霉素处理细胞什么作用

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一、小鼠胚胎成纤维细胞的培养

一、小鼠胚胎成纤维细胞的培养

小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）作为原代培养细胞，具有强大而可靠的刺激增殖能力，易于培养且来源丰富，常被用作干细胞培养的饲养层。一方面提供刺激干细胞增殖的各种因子，另一方面维持干细胞的未分化状态。尽管MEF的传代次数有限，但它可以在早期冷冻，持续复苏并长期维持。MEF的缺点是不能耐受G418的筛选。

另一种方法是从持续表达neo抗性的小鼠品系或转基因品系中分离和培养MEF。各种转基因小鼠培养的MEF细胞也是研究各种基因功能的良好工具。（1）材料12.5 ~ 14.5天小鼠胚胎（3~6只小鼠/次），培养皿（直径10 cm），DMEM 10%新生牛血清，15cm或50cm离心管（圆底），由PBS制备的0.05%胰蛋白酶/EDTA0.02%消化液，解剖刀，镊子，剪刀和其他仪器。

（二）操作步骤1。一般操作（1）在培养皿中，解剖小鼠胚胎并用汉克斯溶液洗涤。（2）摘除四肢、大脑和内脏（肝脏）。（3）用无菌汉克斯溶液++PBS冲洗3次。（4）放在培养皿中，通过手术将其切成块。（5）将切好的组织移入50毫升离心管中，加入约10毫升消化液。（6）在37C下摇动10分钟（在水浴或培养箱中）。

（7）吸取5ml上清液至另一个50ml离心管中，加入等体积的含10%新生牛血清的DMEM培养液中和胰蛋白酶。（8）在原来的离心管（含有组织）中加入4毫升消化液，倒置振荡，10分钟后将5毫升上清液吸入另一离心管中，加入5毫升含10%新生牛血清的DMEM培养液。（9）重复上述步骤约5次，此时，离心管中只剩下无法消化的软骨。（10）离心50毫升离心管并添加50毫升含10%新生牛血清的DMEM培养基。

（11）取适量移至培养皿或培养瓶中培养。（12）第二天更换液体，直到细胞充满（汇合）并以1: 10传代。当细胞生长到合适的密度时，它们可以被冷冻。（13）根据实验需要复苏细胞。由于MEF细胞的代次有限，因此应尽可能保留同代细胞进行平行实验。2.丝裂霉素处理或射线处理后用作饲养层的MEF细胞也必须用丝裂霉素处理或干射线处理，步骤如下。

（1）将冷冻的MEF细胞（5104细胞/cm2）用丝裂霉素处理，以确保一层是满的并且没有留下空间。将铺满状态的MEF加入新制备的含10%新生牛血清和10g/ml丝裂霉素C的DMEM培养基中，在37和5% CO2的培养箱中培养2~3h。用PBS彻底冲洗几次，用胰蛋白酶消化，以每分钟1000转的速度离心5分钟，收集沉淀物，用新的培养液悬浮，并调节浓度至3105g /ml。将细胞接种到用明胶预处理的培养皿中。

（明胶预处理：在0.1%的明胶溶液中浸泡2小时，去除多余的明胶并让其自然干燥。（2）用射线处理融合状态的MEF细胞，并用30100 gy射线处理。胰蛋白酶消化、细胞收集、离心（每分钟1000转，10分钟）、计数和在明胶预处理的培养皿中接种。经射线处理的细胞也可以在5106细胞/毫升的浓度下冷冻。复苏后，可将一个冷冻管接种到4~5个直径为6厘米的培养皿中。

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