流式细胞术指南可准确估计植物基因组大小

北卡罗来纳州立大学研究人员最近发布的一项研究为使用流式细胞术准确估计植物基因组大小提供了新的见解和指导。

流式细胞术已广泛用于估算植物基因组的相对和绝对大小(DNA含量)，已有50多年的历史。然而，这些估算的准确性可能因多种因素而存在很大差异，包括参考标准的基因组大小估算误差和各种实验方法。

这项最新研究重新审视了长期以来的假设，确定了变异来源，并建立了最佳实践和参考标准，更新了基因组大小，以提高基因组大小估计的精度和可靠性。它还严格审查了所使用的方法，并提供了解决不一致和提高准确性的指南。这项研究发表在《美国园艺学会杂志》上。

本研究的具体目标是重新评估常用参考标准的基因组大小，并量化使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和碘化丙啶(PI)荧光染料估计植物基因组大小时因缓冲液、混杂植物组织、组织类型和植物参考标准而产生的变异和误差来源。进行了五项独立研究以阐明这些目标。

第一项研究集中于荧光染料效应。植物流式细胞术中使用多种荧光染料，但它们对整个基因组染色的有效性、染色质对染色效果的影响以及缓冲液和植物代谢物对染料荧光的影响仍在很大程度上未知。

由于染色、碱基对偏差和孵育时间的差异，使用不同的荧光染料所估计的植物基因组大小存在显著差异。此外，诸如对密集染色质的染色效果和荧光对干扰代谢物的敏感性等因素也会影响基因组大小估计的准确性。

第二项研究调查了缓冲液的作用，这对于流式细胞术样品制备中的细胞核分离和染色至关重要。这些缓冲液可以单独使用或组合使用，通常包括表面活性剂、等渗剂、pH缓冲液、酚类结合剂(如聚乙烯吡咯烷酮)、DNA保存化合物(如精胺)以及RNA或蛋白质降解酶。

由于组织类型、形态和代谢物组成的多样性，缓冲液针对特定应用进行了优化，常用的缓冲液多达28种。

第三项研究对代谢物的影响进行了分类。植物中多种次生代谢物在不同的分类群和组织中存在显著差异，导致使用流式细胞术估算基因组大小时出现错误。花青素、咖啡因、绿原酸、香豆素、鞣花酸、单宁酸等化合物可与荧光染料和核DNA相互作用，导致低估或高估基因组大小。

第四项关于组织类型影响的研究发现，植物组织的选择会显著影响使用流式细胞术进行的基因组大小估计。影响这一结果的因素包括器官来源、组织状态(活的、死的或固定的)以及细胞溶质化合物的存在。不同组织中不同类型和数量的次级代谢物可能会造成组织特异性干扰。

参考标准效应构成了第五项研究。在流式细胞术中，包括已知基因组大小的参考标准对于准确计算未知样本的基因组大小至关重要。使用人类男性白细胞作为主要标准，使用更新的基因组大小(6.15pg;比早期研究低12.14%)，使用DAPI和PI荧光染料确定了常用植物参考标准的基因组大小的修订估计值。

结果表明，流式细胞术可以精确、重复地测定植物基因组的相对大小和倍性，在使用一致的方法时，它对近亲植物很有价值。然而，准确测定绝对基因组大小仍然具有挑战性，应该被认为是近似的，潜在误差为±29%或更高。

影响准确度的因素包括荧光染料、提取缓冲液、组织类型、参考标准和植物代谢物，这些因素都会影响荧光染料结合和荧光。

总体而言，无论使用何种荧光染料，流式细胞术都可以精确、可重复，并且对于使用一致的方法确定近缘植物的相对基因组大小和倍性极具价值。

然而，流式细胞术准确测定绝对基因组大小仍然难以实现，使用流式细胞术估计的基因组大小应被视为粗略近似值，可能会因实验方法和植物环境的不同而有±29%或更多的差异。还提供了最佳实践的其他建议。

这项研究对研究人员、育种家和生物技术专家具有重要意义。准确的基因组大小估计对于各种应用都至关重要，包括植物育种、基因图谱和生物多样性研究。这项研究制定的新指南和参考标准有望进一步提高流式细胞术估计植物基因组大小的准确性和精确度。

据作者称，“我们的实验室积极参与植物育种、遗传学、细胞遗传学和作物改良，流式细胞术是快速估计植物倍性和相对基因组大小的极其有价值的工具。然而，在使用这项技术几十年后，很明显这些估计值很容易受到方法论变化的影响。

“由于流式细胞术在使用一致的方法时是精确且可重复的，因此人们经常错误地认为它是‘准确的’。在这项研究中，我们能够重新评估常用参考标准的基因组大小，并量化估计植物基因组大小时因使用不同组织和方法而产生的变异和误差来源，这些变异和误差可能导致±29%或更高的误差。

“此外，使用过时的基因组大小估计值的参考标准会导致12%或更多的额外误差。这项研究提供了参考标准基因组大小的改进估计、量化的误差来源，并推荐了改进植物基因组大小估计的最佳实践。”