通过一步组织扩张实现纳米级光学显微镜

对细胞中的纳米级结构进行成像的传统方法是使用高功率、昂贵的超分辨率显微镜。作为替代方案，麻省理工学院的研究人员开发了一种在成像之前先扩张组织的单步技术，从而可以使用传统光学显微镜实现纳米级分辨率。在这种分辨率下(约20纳米)，可以看到细胞内的细胞器以及蛋白质簇。

研究团队提出了一种简单、廉价的方法，他们称之为20ExM，这种方法可以为几乎所有生物实验室进行纳米级成像铺平道路。麻省理工学院Y.EvaTan神经技术教授EdwardBoyden博士说：“20倍的扩展让你进入了生物分子运作的领域。”“生命的基石是纳米级的东西：生物分子、基因和基因产物。”Boyden是生物工程、媒体艺术与科学以及大脑和认知科学的教授;霍华德休斯医学研究所的研究员;麻省理工学院麦戈文脑研究所和科赫综合癌症研究所的成员。

“这让成像变得大众化，”麻省理工学院诺华化学教授、麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所及麻省理工学院科赫综合癌症研究所成员LauraKiessling博士补充道。“如果没有这种方法，如果你想要以高分辨率观察物体，你就必须使用非常昂贵的显微镜。这项新技术让你能够看到用标准显微镜通常无法看到的东西。它降低了成像成本，因为你无需专门的设备就能看到纳米级的东西。”

Kiessling和Boyden是该团队在《自然方法》杂志上发表的论文的共同资深作者，该论文题为“单次20倍扩展显微镜可在传统显微镜上实现18纳米分辨率成像”，他们在论文中得出结论：“20ExM可能在需要高分辨率成像的生物学研究的许多领域中发挥作用。”该论文的主要作者是麻省理工学院研究生ShiweiWang和TayWonShin博士。

作者写道，在完整的细胞和组织中以纳米级精度识别和定位生物分子是了解它们在这种生物系统中的作用的关键。博伊登的实验室于2015年发明了膨胀显微镜。该技术需要将组织嵌入吸收性聚合物中，并分解通常将组织结合在一起的蛋白质。当加入水时，凝胶会膨胀并将生物分子彼此拉开。“嵌入的样本经过化学软化并将水凝胶浸入水中后，聚合物网络会各向同性地膨胀，同时保持锚定分子的相对空间组织，”研究人员进一步解释说。“膨胀显微镜(ExM)提供了一种强大、简单且经济实惠的解决方案，因为它的各向同性物理放大功能可以在传统显微镜上对保存的细胞和组织进行纳米级分辨率成像。”

ExM技术的原始版本可将组织扩大约四倍，使研究人员能够获得分辨率约为70纳米的图像。2017年，Boyden的实验室修改了该过程，加入了第二个扩大步骤，实现了整体20倍扩大。这可以实现更高的分辨率。扩大20倍后，研究人员使用传统光学显微镜可以将分辨率降至约20纳米。这让他们能够看到细胞结构，例如微管和线粒体，以及蛋白质簇。但是，这个过程更加复杂。“以前的ExM方法要么一次性将样本扩大到有限范围(线性扩大约4-10倍)，要么通过将第一种凝胶重新嵌入第二种水凝胶中，然后再次重复扩大过程(线性扩大共约15-20倍)来实现更高的扩大倍数，”该团队评论道。

Boyden补充道：“我们过去开发过几种20倍扩展技术，但它们需要多个扩展步骤。如果你能在一个步骤中完成如此大的扩展，那么事情就会变得简单很多。”

在他们最新报告的工作中，研究人员着手仅用一个步骤就实现了20倍的膨胀。这意味着他们必须找到一种吸水性极佳且机械稳定性好的凝胶，这样它在膨胀20倍时才不会破裂。“……需要一种具有出色机械性能的聚合物，”研究人员指出。

为了实现这一目标，该团队使用了一种由N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAA)和丙烯酸钠(SA)组装而成的凝胶。与之前依赖添加另一种分子在聚合物链之间形成交联的膨胀凝胶不同，这种凝胶会自发形成交联并表现出强大的机械性能。他们进一步表示：“我们选择优化由N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAA)和丙烯酸钠(SA)组成的水凝胶，这两种试剂已知能够形成机械强度高且有弹性的水凝胶，这是因为DMAA具有独特的自交联化学性质。”

这种凝胶成分以前曾用于膨胀显微镜方案，但得到的凝胶只能膨胀约10倍。麻省理工学院的研究团队优化了凝胶和聚合过程，使凝胶更加坚固，并允许膨胀20倍。

为了进一步稳定凝胶并提高其可重复性，研究人员在凝胶化之前从聚合物溶液中除去了氧气，这可以防止干扰交联的副反应。此步骤需要将氮气通入聚合物溶液，以取代系统中的大部分氧气。

凝胶形成后，将组织结合在一起的蛋白质中的特定键被破坏，然后加入水使凝胶膨胀。膨胀完成后，组织中的目标蛋白质就可以被标记和成像。“与其他超分辨率技术相比，这种方法可能需要更多的样品制备，但在实际成像过程中，尤其是3D成像方面，它要简单得多，”Shin说。“我们在手稿中记录了分步协议，以便读者可以轻松阅读。”

利用这项技术，研究人员能够对脑细胞内的许多微小结构进行成像，包括被称为突触纳米柱的结构。这些是神经元突触处以特定方式排列的蛋白质簇，使神经元能够通过分泌多巴胺等神经递质相互交流。

在癌细胞研究中，研究人员对微管进行了成像——微管是一种中空的管子，有助于形成细胞结构并在细胞分裂中发挥重要作用。他们还能够看到线粒体，甚至可以看到单个核孔复合体的组织，核孔复合体是控制进入细胞核的蛋白质簇。“在一轮扩展中，这个我们称之为20ExM的方案在传统的共聚焦显微镜上揭示了培养细胞中的中空微管结构和小鼠体感皮层中的突触纳米柱，”作者报告说。“…20ExM仅通过一个扩展步骤就实现了与迭代扩展方法(~20nm)相当的分辨率。”

王现在正在使用这项技术对碳水化合物(即聚糖)进行成像，聚糖存在于细胞表面，有助于控制细胞与环境的相互作用。这种方法还可用于对肿瘤细胞进行成像，使科学家能够比以前更容易地了解蛋白质在细胞内的组织方式。

作者总结道：“我们预计20ExM将在生物学领域得到广泛应用，因为它性能高、操作简单……正如细胞培养和组织标本所证明的那样，20ExM可以立即部署到需要高分辨率和单步简单性的各种实验环境中。原则上，20ExM可用于简化和/或提高其他基于扩展的技术的分辨率，例如原位RNA检测和测序、基因组成像、多重蛋白质组学以及脂质和聚糖染色。”

研究人员设想，任何生物实验室都应该能够以低成本使用这种技术，因为它依赖于标准的、现成的化学品和常用设备，如共聚焦显微镜和手套袋，大多数实验室已经拥有或可以轻松获得这些设备。

王说：“我们希望，有了这种新技术，任何传统的生物实验室都可以在现有的显微镜上使用该协议，从而达到只有使用非常专业且昂贵的最先进显微镜才能达到的分辨率。”