研究人员开发出一种分子生物传感器只有与目标结合时才会发光

生物传感器——利用生物分子检测目标物质存在的装置——在检测疾病生物标志物、各种生物过程中的活动分子或环境中的毒素和其他有害物质方面具有巨大潜力。

最常见的一种类型是荧光生物传感器，它由一个靶标结合生物分子与一个发射荧光的探针分子组成。然而，荧光生物传感器通常是低对比度试剂，因为它们的荧光探针始终处于“开启”状态，未结合的生物传感器分子需要被冲洗掉，然后才能检测到准确的信号。

向前迈出的重要一步是高对比度的“结合激活荧光生物传感器”(纳米传感器)，它们只有与目标分子结合时才会发光，但创建这种纳米传感器具有挑战性，因为有效的目标结合和荧光开关需要结合在一个小的分子包中，该分子包还可以有效地输送到各种类型的样品中，并可以大规模生产，具有成本效益。

现在，哈佛大学Wyss研究所、哈佛医学院(HMS)、麻省理工学院和英国爱丁堡大学的合作研究团队开发了一个合成生物学平台，以简化小型高效纳米传感器的发现、分子进化和经济高效制造，这些传感器可以在不到一秒的时间内将荧光增加100倍来检测特定的蛋白质、肽和小分子。

作为关键组成部分，该平台使用新的荧光氨基酸(FgAA)，借助创新方法可以将其编码成靶标结合的小蛋白质序列(结合剂)，从而实现遗传密码的体外扩展。

通过高通量传感器筛选、验证和定向进化的过程，该平台能够快速且经济高效地将蛋白质结合剂转化为高对比度纳米传感器，广泛应用于基础研究、环境监测、医学诊断和增强治疗。研究结果发表在《自然通讯》上。

领导这项研究的Wyss核心教员GeorgeChurch博士表示：“我们长期致力于扩展细胞的遗传密码，赋予它们新的能力，以推动不同领域的研究、生物技术和医学发展，这项研究是这项努力在体外的一个非常有前景的延伸。”

“这种新颖的合成生物学平台解决了利用新化学物质升级蛋白质的许多障碍，例如功能更强大的即时生物传感器，并将对许多生物医学领域产生影响。”

丘奇是怀斯研究所合成生物学平台的负责人，也是哈佛大学医学院罗伯特温思罗普遗传学教授以及哈佛大学和麻省理工学院健康科学与技术教授。

蛋白质加支架等于纳米传感器

该团队由共同第一作者和共同通讯作者、Church团队的博士ErkinKuru领导，在之前的发现基础上进行了研究，即FgAA可以将已知的蛋白质结合剂转化为光学传感器，当FgAA夹在其结合剂序列和目标分子之间时，光学传感器的荧光就会打开。

Wyss的研究人员与共同通讯作者、爱丁堡大学教授、转化化学和生物医学成像专家MarcVendrell博士合作开展了这项研究，Kuru和他一样，对FgAA有着浓厚的兴趣。

从疫情开始，该团队就首先设想了一种“即时COVID-19诊断”，并专注于研究一种可与病毒表面的SARS-CoV-2刺突蛋白结合的微型工程抗体(纳米抗体)。

他们创造了数百种粘合剂变体，其中他们通过将基因引入已知与Spike靶标紧密接触的位置的半胱氨酸或赖氨酸氨基酸与20种不同的化学荧光支架之一进行化学连接，从而组装FgAA。

他们使用一种简单的结合试验，选出了在目标结合后几毫秒内产生最高荧光增加的荧光变体。

然后他们使用相同的过程从纳米抗体或微型蛋白质设计出纳米传感器，这些纳米抗体或微型蛋白质可以与不同的SARS-CoV-2靶位以及一系列其他分子靶标结合，包括与癌症相关的细胞生长因子受体EGFR、细胞生物学家用来追踪细胞内蛋白质的ALFA标签肽，以及应激激素皮质醇。

重要的是，纳米传感器还能在显微镜下有效地显示人体细胞和活细菌中目标的存在，证明了其作为有效成像工具的效用。

纳米传感器的进化

尽管该平台潜力巨大，但其第一版受到限制，因为它依赖于耗费大量人力和时间的过程，涉及对产生的结合序列进行多个纯化步骤。“我们希望通过提高平台的高通量能力，进一步扩大我们的分子设计空间，”Kuru说道。

“为了实现这一目标，我们让核糖体(它能自然合成细胞中的所有蛋白质)在经过设计的无细胞过程中完成大部分工作。”

在2.0版平台中，该团队预制了一种所谓的“合成氨基酸”，并预先连接了荧光支架。合成氨基酸已在减肥药Ozempic等治疗中证明了其价值;然而，它们无法轻易整合到蛋白质序列中，因为没有天然机制让核糖体处理它们。

“为了克服这一障碍，我们在一种新的遗传扩展化学方法的帮助下重新分配了通用遗传密码中一个很少使用的密码子，以便它能够像我们预先制造的非标准FgAA一样编码合成氨基酸。

本质上，我们改造了蛋白质合成过程，以构建结合激活的荧光纳米传感器，”共同开发该方法的第一作者、JonathanRittichier博士说。

他们的新工艺不仅使研究人员能够一次生产出数百万个纳米传感器候选物，而且还有助于加速纳米传感器的后续测试，因为整个合成混合物可以直接与目标分子结合或添加到活细胞中而无需任何额外的净化。

他们现在可以在一天内研究数百种变体，而不是在几周内研究几十种变体。为了凸显该先进平台的强大功能，他们在原始SARS-CoV-2纳米抗体结合剂中发现了一个编码FgAA的特定位置，出乎意料的是，在接触Spike靶蛋白时，该纳米传感器的亲和力比其原始COVID-19纳米传感器更高。

最后，由于这将大大增加制造出更优质纳米传感器的潜力，该团队利用他们的平台来优化纳米抗体序列本身。他们利用了一种经典的合成生物学过程，即“定向进化”，其中蛋白质通过迭代设计-构建-测试循环进行优化，使用在一个循环中确定的具有最大能力的蛋白质版本作为在下一个循环中找到更好的蛋白质版本的基础。

从他们之前设计的用于即时检测原始SARS-CoV-2毒株的Spike蛋白的最佳纳米传感器开始，Kuru、Rittichier和团队创建了广泛的纳米抗体库，其中包含的变体将非标准FgAA保持在原始位置，但在其他关键位置上有许多其他标准氨基酸被结构不同的氨基酸取代。

通过进一步进化其中最好的，他们得到了新的纳米传感器，其对Spike蛋白的结合亲和力高出几个数量级。有趣的是，通过使用这种定向进化系统的调整版本，他们发现了能够选择性检测不同较新的omicron变体的纳米传感器。

文德雷尔说：“这是我们快速设计低成本荧光生物传感器的重要一步，可用于实时疾病监测，在诊断和精准医疗方面具有巨大潜力。”

Kuru补充道：“我们还可以将具有许多其他功能的合成氨基酸整合到各种蛋白质中，以创造新的治疗方法和更广泛的研究工具。”

事实上，Kuru和合著者HelenadePuig博士和AllisonFlores，以及Church和资深作者兼Wyss核心教员JamesCollins博士也已着手Wyss研究所的AminoX项目，该项目利用该平台开发新的疗法。

“这项高度创新的工作使新一代更强大的结合激活生物传感器成为可能，展示了合成生物学的非凡力量。

“Wyss团队成功地将一个基本的生物过程设计成一个平台，这个平台具有巨大的潜力，最终可以解决许多诊断和治疗问题，”Wyss创始董事、医学博士、哲学博士唐纳德·英格伯(DonaldIngber)说道。他同时还是哈佛医学院和波士顿儿童医院的JudahFolkman血管生物学教授以及SEAS的HansjörgWyss生物启发工程教授。