翻译的快照可以帮助我们研究细胞蛋白质

分子生物学的进步表明，pep-tRNA(核糖体内的新生多肽，与转移 RNA 共价结合)参与多种细胞功能，包括基因表达。所有蛋白质在某个时候都以 pep-tRNA 形式存在，研究这些翻译中间体至关重要，因为它们同时具有 RNA 和蛋白质的特性，可以帮助研究人员更好地了解翻译的细节。根据刺激和/或压力，翻译调节非常迅速，跨越起始、延伸和延伸暂停。因此，要想更深入地了解翻译过程，就需要一种合适的方法来大量处理 pep-tRNA。这些细微差别推动了研究细胞翻译的分子工具的发展。

目前，用于调查细胞翻译的两种主要方法利用了截然不同的策略。第一种是核糖体分析，这是一种强大的深度测序技术，它通过靶向核糖体保护的核糖体酶消化产生的 mRNA 片段来监测翻译。不幸的是，这种方法本质上无法捕获 pep-tRNA，耗时、昂贵且数据密集。替代方案依赖于蛋白质组学和液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS)，并且需要使用不寻常的氨基酸来标记多肽。然而，这种蛋白质组学方法需要大量时间，而且最重要的是，不能捕获细胞的翻译延伸状态，因为 pep-tRNA 不是直接靶向的。

为了解决“pep-tRNA-ome”技术中的这些局限性，由 Hideki Taguchi 教授领导的东京工业大学 (Tokyo Tech) 的科学家团队开发了 PETEOS。他们的发现现已发表在Nucleic Acids Research上。关于他们工作的主要优势，Taguchi 教授解释说：“这种非标记方法的独特之处在于它可以专门丰富和快速捕获 pep-tRNA，同时仍然可以补充传统的翻译组分析平台。”

PETEOS 有四个步骤。首先，使用有机溶剂提取法富集 RNA，然后在硅胶柱上分离。接下来，使用高 pH 和温度的组合将分离的 pep-tRNA 中的目标多肽与其核糖核苷酸分离。然后，将释放的多肽进行酶消化并切割。最后，使用鸟枪 LC-MS/MS 蛋白质组学鉴定这些多肽。“作为概念验证，我们能够使用 PETEOS 识别近 800种源自 pep-tRNA 的大肠杆菌蛋白质。重要的是，这些蛋白质富含 N 末端，这表明该方法确实捕获了中间体 pep -翻译过程中的 tRNA 池。”，田口教授在被问及他们的新方法的重要性时说。

该团队还能够证明，当大肠杆菌细胞受到热休克和抗生素治疗时，PETEOS 可以捕获新生组的“屏幕截图”——在任何给定时间存在的新生 pep-tRNA 库。PETEOS 在热应激下捕获急性蛋白质表达的能力以及接触不同抗生素后新生组的重排方面优于传统方法。

PETEOS 确实有一些局限性，包括难以使用 LC-MS/MS 分析低丰度的 pep-tRNA，由于酸性苯酚/氯仿步骤导致定量能力有限，没有密码子水平的分辨率，以及难以捕获 C 末端生长的多肽。然而，其中一些问题也存在于传统方法中，可以通过提高该过程的 C 末端肽富集效率来克服。

该团队认为，有巨大的潜力来优化他们的协议向前发展。田口教授总结说：“尽管存在局限性，但我们相信 PETEOS 具有潜力，因为它可以进行当前翻译组方法根本无法进行的分析。最重要的是，它可以应用于任何生物体!” 随着对该领域的更多研究，我们将加深对蛋白质合成的理解。